Vorbereitung großer biologischer Proben für hohe

Nature Protocols Band 18, Seiten 1441–1461 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Bildgebung in verschiedenen Maßstäben ist für das Verständnis gesunder Organmorphologie und pathophysiologischer Veränderungen von entscheidender Bedeutung. Die dreidimensionale Morphologie großer Proben, einschließlich intakter menschlicher Organe, im Makro- und Mikromaßstab ist mit der Röntgenmikrotomographie (unter Verwendung von Labor- oder Synchrotronquellen) möglich. Die Vorbereitung großer Proben für die hochauflösende Bildgebung ist jedoch aufgrund von Einschränkungen wie Probenschrumpfung, unzureichendem Kontrast, Bewegung der Probe und Blasenbildung während der Montage oder des Scannens eine Herausforderung. Hier beschreiben wir die Vorbereitung, Stabilisierung, Dehydrierung und Montage großer Weichgewebeproben für die Röntgenmikrotomographie. Wir beschreiben ausführlich das Protokoll, das auf ganze menschliche Organe und die hierarchische Phasenkontrasttomographie an der Europäischen Synchrotronstrahlungsanlage angewendet wird. Es ist jedoch auf eine Reihe biologischer Proben, einschließlich vollständiger Organismen, anwendbar. Das Protokoll erhöht den Kontrast bei der Verwendung von Röntgenbildgebung und verhindert gleichzeitig Probenbewegungen während des Scans, selbst bei unterschiedlichen Probenausrichtungen. Während der Montage eingeschlossene und beim Scannen gebildete Blasen (im Fall der Synchrotron-Röntgenbildgebung) werden durch mehrere Entgasungsschritte gemildert. Die Probenvorbereitung ist auch mit Magnetresonanztomographie, Computertomographie und histologischer Beobachtung kompatibel. Die Probenvorbereitung und -montage dauert für ein großes Organ wie ein ganzes menschliches Gehirn oder Herz 24–36 Tage. Die Vorbereitungszeit variiert je nach Zusammensetzung, Größe und Brüchigkeit des Gewebes. Die Verwendung des Protokolls ermöglicht das Scannen intakter Organe mit einem Durchmesser von 150 mm und einer lokalen Voxelgröße von 1 μm. Das Protokoll erfordert Benutzer mit Fachkenntnissen im Umgang mit menschlichen oder tierischen Organen, im Laborbetrieb und in der Röntgenbildgebung.

Die Quantifizierung der Morphologie menschlicher Organe sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitszustand ist eine komplexe Aufgabe, die durch multimodale räumliche Bildgebungsmodalitäten gelöst werden kann, die sich über Dimensionsskalen erstrecken können. Eine vollständige morphologische Charakterisierung des Gewebes erfordert die Erkennung von Wechselwirkungen zwischen und über Skalen hinweg; Allerdings sind die meisten Bildgebungstechniken entweder durch die Auflösung oder das Sichtfeld begrenzt, was es schwierig macht, makroskopische mit mikroskopischen Beobachtungen und Daten zu verbinden. Herkömmliche Ansätze der Histologie1,2,3 oder Elektronenmikroskopie4,5,6 ermöglichen die Visualisierung der mikrostrukturellen Organisation und Zusammensetzung des Gewebes durch serielle Schnitte, und die Daten können entsprechend quantifiziert werden; Allerdings erfordern diese Ansätze normalerweise eine Probenentnahme und das Schneiden des Gewebes und sind äußerst arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Optisches Clearing in Kombination mit Lichtblattmikroskopie kann ein großes Sichtfeld mit hoher Auflösung liefern; Allerdings erfordert die Gewebereinigung auch einen großen Zeitaufwand und ist oft teuer; Darüber hinaus ist die Abbildungstiefe eines Lichtblattmikroskops durch den Arbeitsabstand der Objektivlinse begrenzt7,8. Selbst wenn ganze erwachsene menschliche Organe8 oder ganze Tiere9 über einen Zeitraum von mehreren Monaten entfernt wurden, bleibt die Bildgebung eine Herausforderung. Ähnliche Nachteile gelten für die optische Kohärenztomographie10,11, die Multiphotonenmikroskopie12 oder die konfokale Mikroskopie13,14, die die lokale dreidimensionale (3D) Mikrostruktur des Gewebes auf zellulärer Ebene erfassen können, aber nur eine begrenzte Gewebedurchdringung aufweisen, was die Bildgebung tiefer Gewebe erschwert15. Kürzlich wurde mithilfe der hochauflösenden Magnetresonanztomographie (MRT) eine isotrope Voxelgröße von 100 µm in einem gesamten menschlichen Ex-vivo-Gehirn erreicht16. Obwohl die MRT zerstörungsfrei ist und über ein großes Sichtfeld verfügt17, reicht die Auflösung immer noch nicht aus, um die Mikrostruktur des Gewebes zu untersuchen. Hierarchische Bildgebungstechniken sind in der Lage, den Kompromiss zwischen Auflösung und Sichtfeld zu überwinden. Bei einem hierarchischen Ansatz werden mehrere Bilder derselben Probe mit unterschiedlichen Auflösungen aufgenommen, um die verschiedenen Maßstäbe zu überbrücken. Mikrocomputertomographie (µCT) wurde verwendet, um die gesamte Lunge mit einer Auflösung von 150 μm Voxeln abzubilden, gefolgt von der anschließenden Entnahme von Biopsiekernen in der Lunge; Diese kleinen Kerne wurden dann mit µCT gescannt, um Voxel von 10 μm zu erhalten18.

Auf dem Gebiet der Röntgenbildgebung wurden im letzten Jahrzehnt erhebliche Fortschritte erzielt, insbesondere bei der Visualisierung von Weichgewebe19. Die Synchrotron-Röntgen-Computertomographie (sCT) hat sich aufgrund ihrer hohen Helligkeit20 als eines der leistungsstärksten röntgenbasierten Bildgebungsverfahren erwiesen und ermöglicht die Beobachtung von Weichgewebe mit hoher Auflösung und ausreichendem Kontrast zur Erkennung mikrostruktureller Komponenten21, z als einzelne Neuronen22 oder Elastinfasern23. Insbesondere die auf Phasenkontrast basierende sCT24 hat in Kombination mit optimierten Probenvorbereitungs- und Montageverfahren umfassende Informationen zur Herzfaserausrichtung25,26 und separat zu den Zellkarten des Gehirns27 geliefert. Unter Phasenkontrastbildgebung versteht man die Erkennung von Phasenverschiebungen eines von einer Probe ausgehenden Röntgenstrahls28. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von Weichteilen, die mit der herkömmlichen Röntgentomographie ohne Kontrastmittel nicht erkennbar wären29. Dennoch sind die Studien mit sCT aufgrund des eingeschränkten Sichtfelds meist auf fetale Organe30, kleine Teilproben erwachsener menschlicher Organe31 oder Organe aus Kleintiermodellen, z. B. Maus32 und Kaninchen33, beschränkt. Einige Studien haben die Abbildung größerer Proben gezeigt, wie z. B. Quastenflosser mit einem Durchmesser von bis zu 10 cm und einer Höhe von 30 cm34,35; Die Voxelgröße war jedoch auf 30 µm begrenzt und die interessierende Struktur bestand aus Hartgewebe oder Knorpel.

Synchrotronquellen der vierten Generation, wie die Extremely Brilliant Source der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), bieten genügend räumliche Kohärenz und Fluss der Strahlen, um intakte menschliche Organe von der Makro- bis zur Mikroskala sichtbar zu machen. Unter Verwendung der Extremely Brilliant Source der ESRF haben wir kürzlich eine Technik namens hierarchische Phasenkontrast-Tomographie36 (HiP-CT) entwickelt, die das Scannen großer intakter menschlicher Organe mit isotropen Voxeln von ~20 µm mit anschließendem Zoomen (ohne Schnitte) ermöglicht, um eine Vergrößerung zu erreichen bis 1 μm isotrope Voxel lokal. Obwohl oft übersehen, sind Probenvorbereitung und -montage von entscheidender Bedeutung, um mit dieser und anderen Techniken höchste Auflösungen zu erzielen, insbesondere bei der Visualisierung großer Weichteilproben, wie z. B. menschlicher Organe, bei denen das Verhältnis von Voxelgröße zu Organdurchmesser 1:150.000 (1 µm) beträgt in 150 mm). Der maximal abbildbare Durchmesser wird durch die Ausrüstung und die Einrichtungsparameter der Strahllinie begrenzt, wie z. B. die Breite des Röntgenstrahls, die Größe des Detektors, die zur Rekonstruktion der Daten verfügbare Rechenleistung und die Größe der Daten. Derzeit beträgt der maximale Organdurchmesser, den wir abgebildet haben, 150 mm, der aktuelle Aufbau wäre jedoch mit einem Durchmesser von bis zu 250 mm mal 500 mm vertikal kompatibel.

Der Erfolg all dieser experimentellen Techniken hängt von der sorgfältigen Vorbereitung der Probe ab, um Bildartefakte zu vermeiden. Die Bildgebung von Weichgewebe mittels µCT oder sCT stellt im Vergleich zu Hartgewebe eine Reihe von Herausforderungen dar. Eines dieser Probleme ist der mangelnde Kontrast bei der Abbildung mit Röntgenstrahlen aufgrund der ähnlichen Dichten der Probenbestandteile. Darüber hinaus gehen die Rückprojektionsalgorithmen, die typischerweise zur Rekonstruktion des 3D-Volumens aus Röntgenprojektionen verwendet werden, davon aus, dass sich die Probe während des Scannens nicht bewegt. Die meisten Probenvorbereitungsmethoden sind darauf ausgelegt, ein Driften oder eine Verformung der Probe zu verhindern, um Bewegungsartefakte zu vermeiden, die die Qualität der Bilder beeinträchtigen würden37. Einige Rekonstruktionsalgorithmen, wie z. B. Bewegungskompensation38,39 oder maschinelles Lernen40,41, wurden entwickelt, um dieses Problem zu lösen42, ihre Bedienung bleibt jedoch komplex und rechenintensiv19.

Obwohl das von uns beschriebene Protokoll auf eine Vielzahl biologischer Proben unterschiedlicher Größe anwendbar ist und eine Reihe von Bildgebungsmodalitäten verwendet, konzentrieren wir uns hier auf Proben, die mithilfe der Synchrotron-Phasenkontrastbildgebung abgebildet werden sollen. Die Methode ist auch auf andere Bildgebungsmodalitäten anwendbar; Allerdings muss das Verfahren möglicherweise entsprechend der Stichprobengröße und der gewählten Modalität optimiert werden (siehe Protokollschritte für mögliche Optimierungsempfehlungen).

Das hier beschriebene Probenvorbereitungs- und Montageprotokoll wurde aus der Notwendigkeit heraus entwickelt, große biologische Volumina wie intakte menschliche Lunge, Gehirn, Herz, Niere und Milz abzubilden. Die Technik ermöglicht das Scannen ganzer Organe mit einer isotropen Voxelgröße von 25 µm. Anschließend werden Bereiche für weitere hochauflösende Scans ausgewählt, ohne dass Biopsien erforderlich sind. Um solch große Strukturen abzubilden, ist ein hochenergetischer Röntgenstrahl erforderlich, der die Proben durchdringt. Für die Organbildgebung verwendeten wir einen polychromatischen Strahl mit einer Energie zwischen 64 und 120 keV. Höhere Energien (bis zu 140 keV) wären jedoch optimal, sofern verfügbar.

Die Vorbereitung und Stabilisierung des Organs für diese Technik ist von wesentlicher Bedeutung, da Dichteinhomogenitäten, Gasblasen oder Bewegungen während des Scannens die Bildqualität erheblich beeinträchtigen würden. Bei der Entwicklung der Methode traten mehrere Herausforderungen auf, wie in den erweiterten Daten in Abb. 1 beschrieben. Blaseneinschluss (während der Montage) und Blasenbildung (während des Scannens) führen beide zu Bewegungsunschärfe und Phasenkontrastartefakten und verringern die Scanqualität. Dieses Problem wurde gelöst, indem die von der Probe absorbierte Dosis begrenzt und mehrere Entgasungsschritte während der Organvorbereitung und -montage durchgeführt wurden. Die Probenbewegung während des Scannens stellt eine weitere Herausforderung dar, insbesondere da die Proben groß sind und daher oft eine lange Zeit (>5 Stunden) für die Abbildung erforderlich ist. Diese Herausforderung wurde gelöst, indem sorgfältig eine Mischung aus zerkleinertem Agargel und Flüssigkeit (in unserem Fall Ethanol 70 %) als Eindeckungsmedium um das Organ herum gepackt wurde. Darüber hinaus erhöhte die Entwässerung des Organs mit Ethanol den Kontrast der Bilder43 und verringerte die Blasenbildung.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Vorbereitung ganzer menschlicher Organe für die Bildgebung mit sCT, µCT, medizinischer CT und MRT vor, das mit einer letzten Stufe der klassischen, in Paraffin eingebetteten Histologie kompatibel ist. In diesem Protokoll beschreiben wir hauptsächlich die Probenvorbereitung und Montage mit Ethanol-Agar; das Röntgenbildgebungsprotokoll mit HiP-CT und seine Anwendung auf eine medizinische Anwendung (Quantifizierung des Schadens, den die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) am Lungengefäßsystem anrichtet)44,45. Kurz gesagt, nach der Fixierung des Körpers (Schritt 1A(i)) werden die Organe extrahiert (Schritt 1A(ii–iii)), durch Eintauchen fixiert (Schritt 2), dehydriert und mit Vakuum entgast (Schritt 4A) oder Thermozyklen (Schritt 4B) je nach Fragilität, montiert mit zerkleinerter Agar-Gel-Mischung (Schritte 5–33) und abgebildet mit sCT (Schritte 34–54), µCT (Schritt 55), klinischer CT (Schritt 55) und MRT (Schritt 55) und schließlich wird eine histologische Analyse durchgeführt (Schritt 56). Einen Überblick über das Verfahren finden Sie in Abb. 1.

Das Protokoll enthält drei Hauptschritte (Organgewinnung und -vorbereitung, Organmontage und Bildgebung), die in farbcodierten Feldern angegeben sind. Das Organ kann entweder aus einer Biobank, bei einer Operation, bei einer abgebrochenen Transplantation oder aus einem gespendeten Körper entnommen werden. Abhängig von der Zerbrechlichkeit des Organs bieten wir zwei Protokolle zur Entgasung an (Vakuumentgasung und Entgasung mit thermischen Zyklen). Sobald die Probe mit dem Agargel fixiert ist, können verschiedene bildgebende Verfahren durchgeführt werden (µCT, sCT, klinische CT und MRT). Nach der Bildgebung kann die Histologie der Probe durchgeführt werden.

Dieses Protokoll wurde für die Vorbereitung ganzer menschlicher Organe für die hochauflösende Abbildung mit HiP-CT entwickelt und optimiert, wie in Abb. 2 dargestellt, und wurde auf verschiedene Organe angewendet, darunter Gehirn, Herz, Lunge, Niere und Milz. Dennoch ist das Organpräparationsverfahren flexibel und kann bei Weichgewebe tierischen Ursprungs oder sogar bei intakten Kleintieren angewendet werden. Eine Liste der mit dieser Methode abgebildeten menschlichen Organe und biologischen Proben sowie die Vorbereitungszeit für jeden Schritt finden Sie in Abb. 3 der erweiterten Daten. Zu den gängigsten Probenvorbereitungsmethoden für die Röntgenbildgebung gehören Fixierung, alkoholische Dehydratisierung, Paraffineinbettung oder kritischer Punkt Trocknen. Einer der Hauptnachteile der Nasseinbettung, wie z. B. des Eintauchens in Alkohol, ist die Probendrift, die zu Bewegungsartefakten führt37. Durch die Einbettung von Paraffin und die Trocknung am kritischen Punkt wird die Probenstruktur verändert, um ihre Steifigkeit zu erhöhen, sodass die Probe über einen langen Zeitraum unbeweglich bleibt.

a, 3D-Ansicht des menschlichen Herzens, aufgenommen mit der Strahllinie BM05 am ESRF. b–d, Querschnitte des Herzens mit einer isotropen Voxelgröße von 25 µm (b), 6,5 µm (c) und 2,5 µm (d). e, Vergrößerung des 2,5-Voxel-Bildes mit Anmerkung zu den beobachteten Hauptstrukturen (ca, Koronararterie; mc, Myozytenzellen; ad, Fettgewebe). Alle grundlegenden Informationen über den Patienten, von dem dieses Organ stammt, finden Sie in der erweiterten Datenabbildung Abb. 2. Alle Experimente folgten den relevanten staatlichen und institutionellen Ethikvorschriften für Menschenexperimente.

In diesem Protokoll wird die Bewegung der Probe durch die Verwendung kleiner Blöcke aus Agargel und zerkleinertem Agargel im Dichtegleichgewicht mit der Montageflüssigkeit verhindert, wodurch die Probe an Ort und Stelle gehalten wird. Scans, die im Abstand von mehreren Monaten an derselben Probe erstellt wurden und mit unserem Organstabilisierungsprotokoll vorbereitet wurden, können einfach mithilfe der manuellen starren Transformation registriert werden. Dies zeigt die Stabilität dieser Methode über lange Zeiträume. Allen Probenvorbereitungsmethoden gemeinsam ist die Gewebeschrumpfung. Dieser Effekt kann die morphologische Quantifizierung behindern und zu fehlerhaften Analysen führen. Im Vergleich zur Paraffineinbettung46,47 und der Trocknung am kritischen Punkt37,48 kann die Probenschrumpfung in diesem Protokoll jedoch durch den Einsatz mehrerer Ethanolbäder in aufsteigenden Ethanolkonzentrationen43 bis zu 70 % gemildert werden, wodurch die Morphologie des Gewebes erhalten bleibt. Darüber hinaus sorgt die Entwässerung der Probe mit Ethanol für einen höheren Kontrast zu µCT43,49 oder sCT50. Dieses Probenvorbereitungsprotokoll ist mit vielen MRT-, klinischen CT- und Histologietechniken (nach 3D-Bildgebung und Demontage) kompatibel. Auch wenn die spezifische Bildgebungsausrüstung möglicherweise spezialisiert ist, kann das Vorbereitungsprotokoll in jedem biologischen Labor mit einem geeigneten Abzug implementiert werden. Die Geräte und Materialien sind bei wissenschaftlichen Standardlieferanten leicht erhältlich, wobei die Spezialausrüstung eine Vakuumpumpe und eine Exsikkatorkammer ist.

Obwohl dieses Verfahren im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsprotokollen mehrere Vorteile bietet, sollten einige Einschränkungen beachtet werden.

Der Zeitpunkt der verschiedenen Schritte des Protokolls einschließlich Fixierung und Entgasung hängt stark von der Zusammensetzung und Größe des Gewebes ab. Im vorliegenden Verfahren geben wir Beispiele für das Timing verschiedener menschlicher Organe; wohingegen der Zeitpunkt für andere Gewebearten getestet und verifiziert werden müsste. In diesem Protokoll finden Sie einige Richtlinien zur Optimierung des Timings.

Während die Fixierung des Organs für den langfristigen Gewebeerhalt von entscheidender Bedeutung ist, verändert sie die mechanischen51,52 und Diffusionseigenschaften des Gewebes, was andere Messungen verfälschen könnte. Trotz der Erhöhung des Bildkontrasts beeinflusst die Ethanoldehydrierung auch die mechanischen Eigenschaften des Gewebes43,53. Dies schränkt die Verwendung dieser Vorbereitungsmethode für In-situ-Tests ein; Wenn das Gewebe jedoch nicht fixiert wird und Ethanol durch Wasser ersetzt wird, ist eine In-situ-Bildgebung möglich13,54. Daher könnte das Protokoll in Zukunft erweitert werden, um dynamische Experimente und die Quantifizierung mechanischer Eigenschaften über einen kurzen Zeitraum abzudecken (da ein biologischer Abbau stattfinden würde). Wenn der durch Ethanol bereitgestellte Kontrast nicht hoch genug ist oder nicht an die experimentellen Anforderungen angepasst ist, könnten verschiedene Kontrastmittel wie Jod-55 oder Wolfram-basierte Kontrastmittel56 verwendet werden, um den Gesamtkontrast des Gewebes zu erhöhen oder bestimmte Komponenten aufzulösen von Interesse13,56. Wenn Agargel für eine bestimmte Anwendung nicht wünschenswert wäre, könnte es durch andere feste oder elastische Medien ersetzt werden, die im Gleichgewicht mit der Einbettungsflüssigkeit stehen und eine relativ amorphe Struktur aufweisen. Beispielsweise kann bei der Montage mit 96 %igem Ethanol statt Agargel auch transparentes Kerzenkristallgel verwendet werden. Bei der Montage mit Wasser können auch Gelatineblöcke oder Polyacrylamidblöcke verwendet werden.

Einer der Hauptnachteile von Nasseinbettungsmethoden ist die Blasenbildung aufgrund der Dosisleistung oder Dosisakkumulation im Fall von sCT57. Diese Blasen können die Probe bewegen oder beschädigen. Darüber hinaus können sie starke Artefakte erzeugen, die die Bildqualität drastisch verringern58. Obwohl Blasenbildung bei anderen Standardaufbereitungsmethoden, z. B. der Paraffineinbettung, ein Problem darstellt, tritt sie bei der Trocknung am kritischen Punkt nicht auf. In diesem Protokoll wird das Problem durch mehrere Entgasungsschritte während des Verfahrens gemildert, wodurch die Blasenbildung während des Scans verzögert wird, und durch die Verwendung energiereicher Röntgenstrahlen mit starkem Phasenkontrast weiter gemildert. Allerdings sind nur wenige Strahllinien für die Abbildung von Weichgewebe mit hoher Energie und ausreichenden Kohärenzeigenschaften und Ausbreitungsfähigkeiten ausgestattet. Die räumliche Kohärenz muss hoch genug sein, dass die Ausbreitungsentfernung so eingestellt werden kann, dass die Dichteschwankung der Probe ohne geometrische Unschärfe unterschieden werden kann. Bei der Niedrigenergie-Röntgentomographie müssen die Entgasungsschritte gewissenhaft durchgeführt und die Dosisleistung aufgrund der Photodissoziation des Wassermoleküls noch sorgfältiger kontrolliert werden.

Biologisches Gewebe kann mit verschiedenen Methoden gewonnen werden. Wenn die Probe direkt aus einer Biobank, einer Operation oder einer verworfenen Transplantation entnommen wird (Schritt 1B), kann sie direkt zur Probenfixierungsphase (Schritt 2) gebracht werden. Wenn die Organe von einem gespendeten Körper stammen, muss eine Organentnahme durchgeführt werden (Schritt 1A(ii)). Die Einbalsamierung des Körpers erfolgt kurz nach dem Tod vor der Organentnahme (durch einen zugelassenen Arzt). Der Körper wird durch Injektion von in einer lanolinhaltigen Lösung verdünntem Formalin in die rechte Halsschlagader fixiert (Schritt 1A(i)). Nach der Ausweidung wird die vollständige Fixierung des Organs durch Eintauchen in 4 % neutral gepufferten Formaldehyd sichergestellt (Schritt 2). Die Dauer der Fixierung wird durch die Größe des Organs bestimmt, z. B. 4 Tage für ein menschliches Gehirn. Stellen Sie beim Ausweiden des Organs sicher, dass so viel umgebendes Gewebe wie möglich entfernt wird, um die Zeit zu verkürzen, in der das Fixiermittel in das Organ eindringt. Auch die Menge des Fixiermittels ist wichtig. Wir empfehlen eine Menge, die mindestens dem Vierfachen des Gewebevolumens entspricht.

Einige Organe, wie zum Beispiel die Lunge, müssen möglicherweise aufgeblasen werden. Dies kann teilweise in der Fixierungsphase erreicht werden, indem Formalin unter kontrolliertem Druck in die Lunge instilliert wird59. Die Lunge wird mit 4 % Formalin durch die Luftröhre mit einer 30 cm hohen Wassersäule perfundiert. Anschließend kann die Luftröhre abgebunden werden, um die aufgeblasene Konfiguration über einen Zeitraum von 2 Tagen aufrechtzuerhalten. Anschließend wird die Lunge nach der Extraktion in eine 4 %ige Formalinlösung getaucht. Nach der Fixierung wird das Formalin durch aufeinanderfolgende Ethanolbäder mit Vakuumpumpen ersetzt und mit der Injektion von Ethanol in die Bronchien gekoppelt, um eine konsistente 3D-Form aufrechtzuerhalten. Eine strikte Druckkontrolle bei der Ethanolentgasung ist mit dem vorgeschlagenen Protokoll derzeit nicht möglich, sollte jedoch durch die Zirkulation von entgastem Ethanol, das bei kontrolliertem Druck instilliert wird, möglich werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Daten auch ohne eine streng kontrollierte Inflation in der Ethanol-Dehydratisierungsphase immer noch einen hohen wissenschaftlichen Nutzen haben.

Das Organ wird mit mehreren vorentgasten Ethanolbädern entwässert. Der Übergang zu 70 % Ethanol muss schrittweise erfolgen, um eine Schrumpfung zu vermeiden43. Als bester Kompromiss zwischen kontrollierter Schrumpfung und ausreichendem Kontrast zur Beobachtung interessierender Strukturen mithilfe des Phasenkontrasts wurde eine Ethanolkonzentration von 70 % gewählt; Je nach Anwendung kann jedoch eine andere Ethanol-Endkonzentration verwendet werden. Während dieses Schritts muss eine Entgasung durchgeführt werden, um im Gewebe vorhandenes freies und gelöstes Gas zu entfernen und so Blasenbildung oder Volumenzunahme während der Bildgebung zu vermeiden. Für menschliche Organe stellen wir je nach Fragilität des Organs zwei Methoden zur Entwässerung und Entgasung vor. Die Vakuumentgasung (Schritt 4A(i–v)) kann für die meisten Organe (Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz) angewendet werden. Das Organ wird bei Raumtemperatur (20 °C) in vier aufeinanderfolgende vorentgaste Ethanolbäder mit Konzentrationen von 50 %, 60 % und 70 % getaucht, gefolgt von einem zweiten 70 %-Bad, um sicherzustellen, dass das Gleichgewicht erreicht wird. Zwischen den Bädern wird ein Entgasungsschritt durchgeführt. Das Gleichgewicht wird im Allgemeinen innerhalb von 4 Tagen für jede Konzentration eines menschlichen Organs wie einer Lunge oder eines Herzens erreicht. Die Entgasung erfolgt mit einer Vakuumpumpe und einem Exsikkator durch sukzessives Herunterfahren auf einen Absolutdruck zwischen 15 und 10 mbar. Die Entgasung gilt als geeignet, wenn bei 10 mbar keine starke Blasenbildung zu beobachten ist. Alternativ wurde ein Temperaturwechsel (zwischen Raumtemperatur und 4 °C) (Schritt 4B(i)) für empfindliche Organe wie das menschliche Gehirn entwickelt, da nach der Verwendung der Vakuumentgasungsmethode36 einige Schäden beobachtet wurden, wenn die Blasen nicht gefunden werden konnten ein Weg aus dem Gehirn. Bei dieser Methode werden vier thermische Zyklen durchgeführt, indem das Organ in vier aufeinanderfolgende Bäder mit 50 %, 60 % und 70 % sowie ein zweites mit 70 % vorentgastem Ethanol getaucht wird. Jeder thermische Zyklus besteht aus dem Eintauchen des Organs in das stark entgaste Ethanolbad bei Raumtemperatur. Der Behälter muss sorgfältig verschlossen werden, um das Einschließen von Luftblasen zu vermeiden. Anschließend wird es 4–5 Tage lang bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. Während dieser Zeit diffundiert das gelöste Gas in das umgebende Ethanol und die Blasen lösen sich zunehmend auf. Nach dieser Zeit müssen die Lösungen und das Organ wieder auf Raumtemperatur gebracht werden und ein neuer Zyklus kann mit einem neuen, stark vorentgasten Ethanolbad gestartet werden. Bei beiden Methoden beträgt die Mindestanzahl an Ethanolbädern vier, um eine Endkonzentration von 70 % zu erreichen, ohne dass es zu einer wesentlichen Schrumpfung kommt. Die Eintauchzeiten müssen an die Art und Fragilität des Organs angepasst und optimiert werden. Das Ergebnis der Entgasung kann überprüft werden, indem eine Röntgenaufnahme des Organs in seinem Gefäß ohne die nachfolgend beschriebenen Eindeckmittel angefertigt wird. Wenn noch einige verbleibende Blasen sichtbar sind, können weitere thermische Zyklen mit Ethanol bei 70 % durchgeführt werden. Organe mit Fettgewebe, wie zum Beispiel das Gehirn, benötigen eine längere Zeit, um sich mit Ethanol auszugleichen. In jedem Stadium kann die Dehydrierung überprüft werden, indem man den Behälter mit dem darin enthaltenen Organ durcheinanderwirbelt und nach Streifen unterschiedlicher Dichte (unterschiedlicher Transparenz) sucht, die sich in der umgebenden Ethanollösung bilden. Dies weist auf das Vorhandensein von Wasser im Ethanol hin.

Die Dehydratisierung von Ethanol reicht aus, um die interessierenden Strukturen mit µCT und sCT bei Verwendung von Phasenkontrast zu beobachten; Es sollte jedoch möglich sein, dieses Protokoll mit der Verwendung eines Kontrastmittels zur Auflösung spezifischer Bestandteile der Probe oder mit weniger empfindlichen bildgebenden Verfahren zu kombinieren56. Das Kontrastmittel muss mit 70 % Ethanol mischbar sein oder sollte vor der Ethanol-Dehydrierung auf das fixierte Organ aufgetragen werden. Kontrastmittel würden die Absorption der Probe erhöhen, was bei Verwendung eines intensiven Synchrotron-Röntgenstrahls zu einer Blasenbildung während der Bildgebung führen könnte.

In Fällen, in denen die Charakterisierungstechnik nicht mit Ethanol kompatibel ist (z. B. MRT zur Diffusion), kann das gleiche Protokoll zur Entgasung und anschließenden Montage unter Verwendung von Wasser mit Formalin in der gewünschten Konzentration angewendet werden. Für In-situ-Anwendungen, die nahezu biologische Bedingungen erfordern, kann dieses Protokoll auch nur mit Wasser verwendet werden, die Proben können jedoch nur wenige Stunden lang verwendet werden, da es zu einem biologischen Abbau kommen würde. Besondere Sicherheitsaspekte (Arbeiten unter einem angepassten Abzug in einem gut belüfteten Labor, Tragen von Handschuhen, Laborkittel, geschlossenen Schuhen und Schutzbrille) müssen beachtet werden, da Lösungen von Formalin oder Ethanol gefährliche Dämpfe erzeugen.

Eines der Hauptprobleme beim Nasseinbetten ist die Entstehung von Blasen. Diese können vom Montageprotokoll herrühren (Blasen in den Organen oder im Montagemedium eingeschlossen) und/oder von sehr hohen Röntgenstrahlendosen, die zur Verdunstung des Ethanols führen (im Falle einer sCT). In beiden Fällen können sie erhebliche Artefakte erzeugen (Abb. 3), und im Falle einer Blasenbildung durch die Röntgendosis führen die Bewegungen der Blasen während des Scannens oft dazu, dass die Scans unbrauchbar werden60,61. Vorläufige Tests zeigten, dass das Entgasen der Probe vor der Bildgebung eingeschlossene Blasen entfernt und die Keimbildung und das Wachstum neuer Blasen verzögert. Daher wurden mehrere Entgasungsschritte in das Protokoll integriert, um die Blasenbildung zu mildern.

a–d, Artefakte aufgrund der Strahlendosis (a,b) oder einer stabilen Blase, die während der Montage eingeschlossen wurde (c,d). a: Ein Querschnitt einer menschlichen Leber mit zahlreichen Blasen, die sich aufgrund einer zu hohen Dosisaufnahme aufgrund eines mehrstündigen Scan-Absturzes mit eingeschaltetem Strahl entwickelt haben, was zu Artefakten in den Bildern führte. Ba, Blasenartefakt. b: Ein Querschnitt der Leber, abgebildet nach der Entfernung von Blasen durch Entgasung der Probe mittels Vakuumentgasung. c, Ein Querschnitt eines menschlichen Gehirns mit einer beim Montieren eingeschlossenen Blase. d, Ein Zoom auf die Blase, die im Gehirn eingeschlossen ist. Die Bilder wurden an der Strahllinie BM05 am ESRF aufgenommen. Alle Experimente folgten den relevanten staatlichen und institutionellen Ethikvorschriften für Menschenexperimente.

Der Zweck dieses Schritts besteht darin, das Organ während des Scans in seiner Position zu halten, um Bewegungsartefakte zu vermeiden und sicherzustellen, dass zu einem späteren Zeitpunkt weitere Scans mit guter starrer 3D-Registrierung zwischen nachfolgenden Scans/Experimenten durchgeführt werden können. Das Agar-Gel kann nicht direkt mit 70 %igem Ethanol hergestellt werden, sondern muss durch langsame Zugabe von Agar-Agar-Pulver in gerührtes heißes demineralisiertes Wasser (~85 °C) bis zu 20 g/L erfolgen. Sobald die Agar-Agar-Lösung vollständig aufgelöst ist, wird sie in einen geeigneten Behälter gegossen und mehrere Stunden lang abkühlen gelassen. Nach dem Gelieren kann die Mischung in kleine Würfel geschnitten werden (Schritt 8) und zu 96 %igem Ethanol (6 l:2 l Ethanol:Agar-Agar) hinzugefügt werden (Schritt 9), um eine endgültige Ethanolkonzentration von 70 % sicherzustellen. Nach dem Entgasen (Schritt 12) und dem Zerkleinern eines Teils der Agarwürfel (Schritt 14) ist die Mischung bereit für die Montage. Wenn die Montage mit Formalin gegenüber Ethanol bevorzugt wird (z. B. um den Kontrast bei der MRT zu verbessern), kann das 96 %ige Ethanolbad durch ein 4 %iges Formalinbad ersetzt werden. Das Agar-Gel kann im Voraus vorbereitet und in einem luftdichten Behälter aufbewahrt werden, um zu verhindern, dass nach dem Entgasen erneut Gas in die Lösung gelangt. Die vorbereitete Menge hängt von der Größe der Orgel und des Behälters ab, der für die endgültige Montage verwendet wird. Ein mit 70 % Ethanol hergestelltes Agargel sorgt für eine drastische Reduzierung der Blasenbildung während der Bildgebung. Es ist wichtig, ein zerkleinertes Agar-Gel und kein gemischtes Agar-Gel zu verwenden, da das gemischte Gel die Probe nicht so fest hält wie das zerkleinerte Agar-Gel und es zu Bewegungen während der Bildgebung kommen kann. Zunächst wurden nur Agarwürfel verwendet, um die Probe an Ort und Stelle zu halten. Es stellte sich jedoch heraus, dass die Würfel zu steif waren und an den Stellen, an denen sie die Oberfläche weicher Organe wie der Lunge berührten, Verformungen verursachten. Daher sollten die Würfel nur unten und oben im Behälter verwendet werden. Ein paar Zentimeter dienen dazu, eine solide Basis zu schaffen und eine Rotation der Probe zu vermeiden (Schritt 16). Für den Rest des Behälters wird zerkleinerter Agar verwendet, um die Probe an Ort und Stelle zu halten. Die Mischung aus zerkleinertem Agar in der Montageflüssigkeit (70 % Ethanol oder 4 % Formalin) muss vorsichtig mit einer Schöpfkelle in den Behälter gegeben werden, um das Einschließen von Gasblasen während des Vorgangs zu vermeiden (Abb. 4c). Bei der Zugabe des zerkleinerten Agar-Gels sollte mindestens dreimal eine schnelle Vakuumentgasung durchgeführt werden, um eingeschlossene Blasen zu entfernen. Diese Vakuumzyklen sollten idealerweise bis hinunter zu 15 mbar durchgeführt werden. Die Abmessungen des Behälters sollten so nah wie möglich an der Probe liegen, um die Materialmenge, die der Röntgenstrahl durchdringen muss, zu minimieren; Allerdings sollte das Organ die Seite des Behälters nicht berühren, um Artefakte in den Bildern zu vermeiden, die die Genauigkeit der Rekonstruktion beeinträchtigen würden (d. h. mindestens 5 mm zerkleinertes Agargel sollten das Organ umgeben, um direkten Kontakt mit dem Behälter zu vermeiden). . Für die sCT muss der für die Montage verwendete Behälter aus einem röntgenstrahlenbeständigen und nicht zu dichten Material bestehen, beispielsweise Polyethylenterephthalat. Glas sollte vermieden werden, da seine im Vergleich zu den Proben hohe Dichte zu starken Absorptionskontrastartefakten führen würde. Sobald das Agar-Gel um die Probe herum verdichtet (Schritt 22) und ordnungsgemäß entgast wurde, kann der Behälter mit einem flüssigkeitsdichten Deckel verschlossen werden (Schritt 28). Bei der Montage ist darauf zu achten, dass keine Bewegung der Probe im Behälter möglich ist und keine Blasen im Inneren sichtbar sind. Wenn einige Blasen eingeschlossen sind, können diese durch eine schnelle Vakuumentgasung entfernt werden. Der gleiche Ansatz kann verwendet werden, um Blasen in einem Organ zu entfernen, wenn aufgrund einer hohen Dosis beim sCT-Scannen eine Blasenbildung auftritt (entgasen Sie den versiegelten Behälter nicht, entfernen Sie den Deckel und legen Sie ein flaches, starres Sieb auf das Agargel, um dies zu verhindern). Bewegen Sie das Organ und entgasen Sie es, ergänzen Sie den Ethanolspiegel, wenn er abnimmt, und fügen Sie schließlich eine kleine Menge zerkleinertes Agargel hinzu, und schließen Sie es dann wieder. Ein Beispiel für unzureichend verdichteten Agar wird im Online-Ergänzungsvideo 1 gezeigt. Wenn das Organ fixiert und in 70 % Ethanol gelegt wird, kann die Probe jahrelang gelagert werden (Abb. 4d).

a, Entgasung des Organs in seinem Behälter mit einem Exsikkator und einer Vakuumpumpe. b,c, Nach der Verdichtung des im Behälter vorhandenen Agar-Gels wird mit einer Spritze und einem Sieb ein Teil des Ethanols entfernt (b) und anschließend Agar-Gel zugegeben (c). Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis das Agargel um die Probe herum ausreichend komprimiert ist, um sie in Position zu halten. d, montierte Probe im Agargel stabilisiert und entgast, bereit zum Scannen. e, Schema eines montierten Gehirns, wie in d, fixiert mit zerkleinertem Agargel und Agarwürfeln, in einem verschlossenen Behälter. Alle Experimente folgten den relevanten staatlichen und institutionellen Ethikvorschriften für Menschenexperimente. Panel-Bild des Gehirns von Smart Servier Medical Art (https://smart.servier.com/), lizenziert unter einer CC BY 3.0-Lizenz.

Die Röntgenbildgebung und die 3D-Rekonstruktion werden in diesem Protokoll nicht im Detail beschrieben; Eine detaillierte Beschreibung ist jedoch in der Literatur36 oder durch Kontaktaufnahme mit den entsprechenden Autoren verfügbar. Diese Methode wurde für die Bildgebung großer Organe mit HiP-CT entwickelt, aber viele Aspekte wären für die klassischere sCT- und μCT-Bildgebung (Laborquelle) an kleineren Proben von Vorteil, einschließlich der Immobilisierung und Kontrastverstärkung im Zusammenhang mit der Ethanolvorbereitung. Sobald die Probe montiert ist, kann das Scannen jederzeit durchgeführt werden. Typische sCT-Bildgebungsergebnisse eines intakten menschlichen Herzens sind in Abb. 2 dargestellt. Die größte Einschränkung dieser Technik ist die Keimbildung und das Wachstum von Blasen nach der Anwendung einer hohen Dosis Röntgenaufnahme des Organs bei sCT. Sollten bei der Bildgebung nur wenige Blasen entstehen, kann die Probe im Kühlschrank bei 4 °C belassen werden, um sie wieder aufzulösen. Gelingt dies nicht, kann die Probe durch Vakuumpumpen erneut entgast werden, ohne dass die Probe abmontiert werden muss. Allerdings kommt es während des Vorgangs zwangsläufig zu geringfügigen Bewegungen der Probe, was den Scan- und Registrierungsvorgang mit mehreren Auflösungen erschwert. Es gibt verschiedene Lösungen, um Blasenbildung während der sCT zu vermeiden, die Erkennung zu optimieren, den relativen Kontrast zu erhöhen, um mit niedrigerer Dosis zu arbeiten, eine bessere Kontrolle der Dosis, eine bessere Datenverarbeitung oder eine Ruhezeit für die Proben zwischen aufeinanderfolgenden Scans derselben Bereich. Die Blasenbildung scheint stark mit der thermischen Wirkung der Dosis auf die Verdunstungsrate des Ethanols zusammenzuhängen. Die Entwicklung von Probenumgebungskammern, die bei niedrigeren Temperaturen arbeiten und ein besseres thermisches Gleichgewicht gewährleisten, kann eine effiziente Möglichkeit sein, das Risiko von Blasenbildung im Zusammenhang mit der Verwendung von 70 %igem Ethanol zu verringern, insbesondere bei mehreren Scans mit Submikronauflösung am selben Organ.

Die in diesem Protokoll vorgestellte Probenvorbereitungsmethode ist mit der MRT kompatibel (Abb. 5c) und eignet sich daher hervorragend für multimodale Studien. Bevor Sie sich für die Probenvorbereitungsmethode und die Scanreihenfolge entscheiden, sollten jedoch eine Reihe von Überlegungen berücksichtigt werden. Die Entwässerung der Probe mit Ethanol erhöht den Kontrast für die Röntgenbildgebung, kann sich jedoch auf die MR-Bilder auswirken62. Die meisten MR-Techniken sind stark vom Wassergehalt abhängig. Durch die Dehydrierung der Probe wird somit der Kontrast zwischen Geweben, die Wasser gut speichern (z. B. Fettgewebe), und solchen, die effizient dehydrieren (z. B. Muskelgewebe), verstärkt. Durch die Verringerung des Gesamtwassergehalts wird jedoch das Signal verringert und einige Techniken wie die diffusionsgewichtete MR sind nicht mehr möglich. Eine Methode zur Überwindung dieses Problems besteht darin, die Probe nicht zu dehydrieren, sondern sie zunächst direkt in einer Formalinhalterung für die Durchführung der MRT vorzubereiten. Der Kontrast für sCT-Bilder wird dann verringert, aber das Signal-Rausch-Verhältnis von MRT-Bildern erhöht. Obwohl formalin- oder paraformaldehydfixiertes Gewebe die am häufigsten verwendete Probenvorbereitungsmethode für die Ex-vivo-MRT ist, wirkt sich diese Technik auch auf die Qualität der Bilder aus63. Die Fixierung von Gewebe mit Formalin oder Paraformaldehyd verringert T1, T2 und die Diffusionsfähigkeit des Gewebes und verringert somit den Kontrast zum Rauschen in Bildern. Ein Ansatz besteht darin, das Gehirn vor der MRT-Bildgebung zu waschen, um das Fixiermittel zu entfernen. Dadurch können die T2-Werte vor der Fixierung, jedoch nicht die T1-Werte wiederhergestellt werden (Lit. 64). Durch das Waschen werden auch die vorangegangenen Entgasungsschritte beeinträchtigt, daher muss die relative Bedeutung jeder Bildgebungsmodalität sorgfältig gegen die gesamte Bildgebungspipeline und die multimodalen Registrierungsanforderungen abgewogen werden.

a, 3D-Ansicht der menschlichen Niere. b: Querschnitt der Niere, aufgenommen mit medizinischer CT, mit einer Voxelgröße von 625 µm. c: Querschnitt der Niere, aufgenommen mit einem medizinischen 3T-MRT, mit einer Voxelgröße von 220 × 200 × 200 µm3. d: Querschnitt der Niere, abgebildet mit sCT, mit einer Voxelgröße von 25 µm auf der BM5 ESRF-Beamline. e, Vergleich von sCT und einem histopathologischen Schnitt, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Die Histologie wurde nach allen anderen bildgebenden Verfahren durchgeführt. Die verwendeten histologischen Techniken sind Standard und in Lit. gut dokumentiert. 72. Die linke Spalte zeigt lichtmikroskopische Bilder von H&E-gefärbten histopathologischen Schnitten, die rechte Spalte zeigt 2D-sCT-Bilder, die an der BM05-Strahllinie am ESRF mit einer Voxelgröße von 1,4 μm aufgenommen wurden. Bilder mit einem Stern oben links wurden pseudofarben (aus der sCT) oder in Graustufen umgewandelt, bevor sie im Kontrast umgekehrt wurden (aus der Histologie). Alle grundlegenden Informationen über den Patienten, von dem dieses Organ stammt, finden Sie in der erweiterten Datenabbildung Abb. 2. Alle Experimente folgten den relevanten staatlichen und institutionellen Ethikvorschriften für Menschenexperimente. Panel e mit Genehmigung von Ref. angepasst. 36, Springer Nature America, Inc.

Das hier beschriebene Protokoll erfordert Vorkenntnisse im Umgang mit menschlichen oder tierischen Organen. Wenn menschliche Organe verwendet werden, sollte ein Pathologe Teil der Studie sein, der sich um die Einbalsamierung des Körpers und die Organpräparation kümmert. Das Entgasen des Organs, die Vorbereitung der Agarlösung und die Montage des Organs erfordern die Fachkenntnis eines Labortechnikers, da diese Schritte den Umgang mit gefährlichen Materialien wie Formalin und Ethanollösung beinhalten. Dieses Protokoll wurde für die Bildgebung großer Organe entwickelt und optimiert. Es ist ein Wissenschaftler mit Erfahrung in CT oder sCT erforderlich, da die Bildgebung solch großer Strukturen nicht trivial ist.

Alle hierin enthaltenen Experimente wurden von der ESRF, dem Laboratoire d'Anatomie des Alpes Françaises und dem Hannover Institute of Pathology an der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt (Ethikvotum Nr. 9022_BO_K_2020). Transport- und Bildgebungsprotokolle wurden von der Gesundheitsforschungsbehörde und dem Integrierten Forschungsanwendungssystem (200429) sowie dem französischen Gesundheitsministerium genehmigt. Bei allen Organpräparationen wurde das Andenken an den Verstorbenen respektiert. Die Obduktionsstudie wurde gemäß den Empfehlungen der Skala „Quality Appraisal for Cadaveric Studies“65 durchgeführt.

Vor der Durchführung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren müssen institutionelle und staatliche Ethikvorschriften zur Verwendung von menschlichem Gewebe in der Forschung eingeholt und befolgt werden. Die konkreten Anforderungen werden von den zuständigen Behörden festgelegt. Üblicherweise sollte eine Ethikkommission das Projekt prüfen, nachdem sie eine geeignete Probe identifiziert hat, entweder aus einer Körperspende oder aus einer Biobank. Sobald das Projekt angenommen wurde, müssen Verträge und/oder Materialtransfervereinbarungen (MTAs) geschlossen werden, um die Bioproben zwischen Institutionen zu transferieren. Der Zeitaufwand für die Einholung der ethischen Vereinbarung und des MTA kann beträchtlich sein (mehrere Wochen bis Jahre), abhängig von den beteiligten Ländern und den Besonderheiten des Vertrags.

Menschliche Organe, die einem gespendeten Körper entnommen werden

Institutionelle und staatliche Ethikvorschriften bezüglich der Verwendung von Menschen für wissenschaftliche Forschung müssen befolgt werden.

4 % neutral gepuffertes Formalin (50 % Hygeco, Kat.-Nr. 07040 + 50 % Hygeco, Kat.-Nr. 07020; verdünnt auf 4 %)

Giftig, krebserregend, mutagen, fortpflanzungsgefährdend und entzündlich. Vorsichtig unter einem Abzug handhaben. Einatmen und Kontakt mit der Haut oder den Augen vermeiden.

Ethanol 96 % (Cheminol France, Kat.-Nr. 20× 4-2)

Agar-Agar (Nature et Aliments, Kat.-Nr. 510190)

Die Geliereigenschaften von Agar unterscheiden sich je nach Hersteller. Für die Reproduktion der hier präsentierten Ergebnisse empfehlen wir die Nutzung des aufgeführten Lieferanten. Wenn andere verwendet werden, wären einige Vorversuche erforderlich.

Demineralisiertes Wasser (Sigma Aldrich, Kat.-Nr. 38796)

Abzugshaube (Iberis-Labor, Kat.-Nr. SPR18)

Handschuhe Nitril (Showa, Kat.-Nr. 7500PF)

Papierhandtücher (Paredes, Kat.-Nr. 404857)

Präparierinstrumente (Fisher Scientific, Kat.-Nr. 11738551)

Vakuumpumpe (Marshall Scientific, Kat.-Nr. VME8)

Vakuumexsikkator (SP Bel-Art, Kat.-Nr. F42400-4031)

Kühlschrank (Fisher Scientific, Kat.-Nr. 22651264)

Großer auslaufsicherer Behälter aus Polyethylenterephthalat (Medline Scientific, Kat.-Nr. 129-0592, oder Lock & Lock, Kat.-Nr. INL-403 oder Lock & Lock, Kat.-Nr. INL-203, dargestellt in der erweiterten Datenabbildung . 4)

Magnetisches Wirbelsystem ausgestattet mit einer Heizplatte (Fisherbrand, Kat.-Nr. 15349654)

Elektrische Reibe (Seb, Kat.-Nr. DO201141)

Schöpflöffel (Tefal, Kat.-Nr. K1180214)

Langes Messer (Ikea, Kat.-Nr. 402.947.22)

Spritze 50 ml (PentaFerte, Kat.-Nr. 002022960)

Sieb (Profilstore, Kat.-Nr. toilinox_PGRI1ME213)

Allzweck-Vinylband (3 M, Kat.-Nr. 764)

Bohrer (DeWALT, Kat.-Nr. DCD791P2-QW)

Behälterhalter (maßgefertigt, beschrieben in Erweiterte Daten Abb. 5 und in Ref. 36)

Aufbau der Synchrotron-Mikrotomographie. Wir haben die Strahllinien BM05 und BM18 des ESRF verwendet. Die Strahllinienparameter aller in diesem Artikel vorgestellten Organscans sind in der erweiterten Datenabbildung 6 detailliert aufgeführt.

Datenrekonstruktion: Dell EMC PowerEdge R7525 Rack Server (Betriebssystem: Ubuntu 20.04.3 LTS; Zentraleinheit: AMD EPYC 75F3 2,95 GHz, 64 Kerne; Speicher: DDR4-3200 32 GB (32×); Grafikeinheit: NVIDIA Ampere A40 ×2; Festplatte: 2,4 TB 10.000 U/min SAS 12 Gbit/s)

Datenvisualisierung: Dell Precision 7920 Tower (Betriebssystem: Windows Server 2016; Zentraleinheit: Intel Xeon Platinum 8160 M Prozessor, 2,10 GHz, 24 Kerne; Speicher: 1,5 TB; Grafikeinheit: NVIDIA Quadro P6000; Festplatte: AVAGO MR9460 -16i SCSI 4,67 TB)

Eigens mit MATLAB 2017 geschriebener Rekonstruktionscode, verfügbar auf GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon)

PyHST2 (3D-Tomographie-Rekonstruktionscode, http://ftp.esrf.fr/scisoft/PYHST2, Open Source), entwickelt von der ESRF

ImageJ/Fiji (Datenvor- und -nachbearbeitung, https://imagej.nih.gov/ij/, http://fiji.sc/, Open Source)

VGSTUDIO MAX Version 3.5 (Volumensegmentierung und Visualisierung, https://www.volumegraphics.com/en/products/vgsm.html)

Alle Experimente, bei denen menschliche Organe verwendet werden, müssen von den zuständigen institutionellen oder staatlichen Gremien ethisch genehmigt werden.

Sammeln Sie das gewünschte Organ entweder durch Entnahme aus einem gespendeten Körper (Option A) oder durch eine Biobank, eine Operation oder eine verworfene Transplantation (Option B).

Einbalsamierung des Körpers und Organentnahme

Timing ~3 Tage

(Optional) Einbalsamieren Sie den Körper nach dem Tod, indem Sie nacheinander 4.500 ml Formalin, verdünnt auf 1,15 % in einer Lösung mit Lanolin, und 4.500 ml Formalin, verdünnt auf 1,44 %, in die rechte Halsschlagader injizieren (durchgeführt von einem zugelassenen Arzt), idealerweise mit einer Jugulardrainage .

Formalin ist flüchtig und hochgiftig. Es reizt Augen, Atemwege und Haut und ist wahrscheinlich krebserregend. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich unter einem chemischen Abzug und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Augenschutz und Laborkittel).

Bei ordnungsgemäßer Fixierung und Kühlung ist der Körper bis zu 2 Jahre haltbar.

Extrahieren Sie die gewünschten Organe aus dem Körper.

Umliegendes Fett und Bindegewebe entfernen.

Organbeschaffung aus einer Biobank

Der Zeitpunkt hängt von den Verwaltungs- und Lieferverzögerungen ab

Holen Sie sich das Organ aus einer Biobank, einer Operation oder einer verworfenen Transplantation. Die Zeit zwischen der Entnahme des Organs und der Formalinfixierung sollte minimal sein. In der Zwischenzeit sollte das Organ bei 4 °C gehalten werden, um eine Schädigung des Gewebes zu vermeiden. Spenderdaten sollten gemäß den behördlichen Vorschriften anonymisiert werden. Die Orgel sollte in einem verschlossenen Behälter transportiert werden.

Zeiteinteilung 4 Tage

(Optional) Fixieren Sie das Organ vollständig, indem Sie es bei Raumtemperatur in 4 % neutral gepuffertes Formalin eintauchen. Wir haben 4 Tage für die Fixierung mit Formalin verwendet, um die Sicherheitsvorschriften im Zusammenhang mit Autopsien im Falle eines Krankheitserregers (z. B. COVID-19) einzuhalten. Wir empfehlen, dass das Formalinvolumen mindestens viermal größer ist als das Volumen des Organs. Die Schätzung des Volumens erfolgt durch den Pathologen, für den dies gängige Praxis ist.

Die Entgasung mit einer Vakuumpumpe sollte unter einem Abzug oder in einem Raum durchgeführt werden, der mit einem Belüftungssystem mit ausreichender Kapazität ausgestattet ist, um das Einatmen von Formalin- oder Ethanolgasen zu vermeiden.

Die Raumtemperatur wurde typischerweise auf 20 °C eingestellt.

(Optional) Waschen Sie die Probe 2 Minuten lang mit Leitungswasser, um das Fixiermittel zu entfernen.

Bereiten Sie das Organ für die Montage vor, indem Sie es mit mehreren Ethanolbädern dehydrieren und unter Vakuum entgasen (Option A). Mit dem Vakuumentgasungsprotokoll konnten Schäden an einigen empfindlichen Organen (typischerweise dem Gehirn) festgestellt werden. Daher wurde ein alternatives Protokoll zur Vorbereitung der Probe ohne Vakuumentgasung unter Verwendung thermischer Zyklen (Option B) entwickelt. Das Ethanol kann durch eine 4 %ige Formalinlösung ersetzt werden, um die Austrocknung der Probe zu vermeiden, wenn dies unerwünscht ist, z. B. bei MR-Bildgebung oder im Fall von Röntgenbildgebung mit einem Kontrast nahe an biologischen Bedingungen. Möglicherweise sind Änderungen an diesem Verfahren erforderlich, da der Zeitpunkt und die Anzahl der Zyklen stark von der Zusammensetzung und Größe des Organs abhängen. Bei Proben unterschiedlicher Herkunft, Art und Größe sollte eine gewisse Optimierung dieses Schritts in Betracht gezogen werden.

Dehydrierung und Vakuumentgasung

Zeitpunkt 16 d

Tauchen Sie die Orgel in ein Bad aus vorentgastem 50 % Ethanol. Die Lösung muss mindestens das Vierfache des Volumens des Organs haben.

Stellen Sie den Behälter mit dem Organ in einen Exsikkator

Entfernen Sie das freie und gelöste Gas im Gewebe, indem Sie den Druck durch aufeinanderfolgende Zyklen mit einer Membranvakuumpumpe verringern, bis starke Blasenbildung auftritt.

Die ersten Zyklen dauern typischerweise 2–3 Minuten und erreichen nach drei bis vier Zyklen 15–30 Minuten für ein menschliches Organ, wie ein Herz oder eine Niere.

Diese Zeiten hängen stark von der Vakuumkonfiguration des Benutzers ab.

Setzen Sie diese Zyklen fort, bis Sie 15–10 mbar ohne starke Blasenbildung erreichen.

Die Entgasung sollte in Zyklen mit erhöhter Dauer erfolgen. Bei jedem Zyklus wird das Vakuumpumpen gestoppt, wenn die Blasenbildung plötzlich stärker wird. Jedes Mal, wenn ein neuer Zyklus beginnt, sollte die Zeit bis zur ersten Blasenbildung zunehmen. Die Entgasungszeit muss je nach Zusammensetzung und Größe jedes Organs angepasst werden. Es gibt keinen typischen Zeitpunkt, er muss empirisch anhand des Bubbling-Regimes ausgewählt werden. Dies hängt stark von der Qualität der Vakuumpumpe und des Exsikkators ab.

Fehlerbehebung

Warten Sie, bis das Gleichgewicht erreicht ist (unsere Tests zeigen, dass normalerweise 4 Tage für ein menschliches Organ wie Lunge, Herz oder Gehirn für jede Ethanolkonzentration ausreichen; bei nur 2 Tagen sahen wir ein unvollständiges Gleichgewicht, das als Dichtegradienten in den Scans sichtbar war).

Wiederholen Sie die Schritte (i–vi) mit drei aufeinanderfolgenden Bädern mit vorentgastem Ethanol bei 60 %, 70 % und schließlich 70 % mit einer Entgasung zwischen jedem Bad.

Führen Sie eine abschließende Entgasung des Organs für einige Minuten durch, bevor Sie es mit dem zerkleinerten Agar-Agar-Gel im Montagegefäß montieren.

Dehydrierung und Entgasung durch thermische Zyklen (alternatives Protokoll für empfindliche Organe)

Zeitpunkt 27 d

Es müssen jeweils mindestens vier thermische Zyklen in sukzessiv höheren Konzentrationen von 50 %, 60 %, 70 % und 70 % Ethanol durchgeführt werden.

Verwenden Sie für jede aufeinanderfolgende Konzentration die Vakuumpumpe, um ein Ethanolvolumen von mindestens dem Vierfachen des Organvolumens bei Raumtemperatur zu entgasen.

Geben Sie das Ethanol in den Behälter mit der Probe und verschließen Sie den Behälter sorgfältig, um Blaseneinschlüsse zu vermeiden.

5 Tage lang bei 4 °C lagern. Das gelöste Gas diffundiert in das umgebende Ethanol und die Blasen lösen sich zunehmend auf. Die Eintauchzeiten müssen an die Art und Fragilität des Organs angepasst und optimiert werden.

Nehmen Sie den Behälter für jeden Zyklus aus dem Kühlschrank, um ihn wieder auf Raumtemperatur zu bringen (ca. 12 Stunden). Zur Messung der Temperatur der Lösung kann ein Thermometer verwendet werden.

Das Ergebnis der Entgasung kann überprüft werden, indem eine Röntgenaufnahme des Organs in seinem Gefäß ohne die nachfolgend beschriebenen Eindeckmittel angefertigt wird. Wenn noch einige verbleibende Blasen sichtbar sind, können weitere thermische Zyklen mit Ethanol bei 70 % durchgeführt werden. Organe mit Fettgewebe, wie zum Beispiel das Gehirn, benötigen eine längere Zeit, um sich mit Ethanol auszugleichen.

Sobald das Organ 70 % Ethanol enthält, kann es Monate bis Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden, bevor mit den Montageschritten des Protokolls fortgefahren wird.

Fehlerbehebung

Timing 12 Stunden bis 2 Tage

Folgendes ergibt 5 l Agargel:

Kochen Sie 5 l demineralisiertes Wasser in einem Behälter mit einer Heizplatte, die mit einem magnetischen Wirbelsystem ausgestattet ist.

Kochendes Wasser oder Dampf können schwere Verbrennungen verursachen. Tragen Sie niemals den vollen Behälter mit der Hand. Rollen Sie es stattdessen auf einem Wagen oder Transportwagen. Tragen Sie Sicherheitsausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, geschlossene Schuhe und Schutzbrille) und arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum.

Sobald die Temperatur über 80 °C liegt, gießen Sie langsam 100 g Agar-Agar-Pulver (20 g/l) in das Wasser und rühren Sie weiter, bis sich alles gut aufgelöst hat.

Nach dem Auflösen das Rühren stoppen und den Rührer mit einer Schöpfkelle entfernen.

Gießen Sie die Flüssigkeit in einen großen Behälter. Normalerweise verwenden wir einen Behälter mit den Maßen 40 × 30 × 12 cm.

Kochendes Wasser oder Dampf können schwere Verbrennungen verursachen. Tragen Sie Sicherheitsausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, geschlossene Schuhe und Schutzbrille) und arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum.

Sobald die Gelierung erreicht ist (ca. 12 Stunden, abhängig von der Temperatur), schneiden Sie das Agar-Gel mit einem langen Messer in Würfel von ca. 2 cm3.

Gehen Sie mit Messern vorsichtig um und konzentrieren Sie sich immer auf das, was Sie tun.

Tauchen Sie die Würfel in 11,7 l 96 %iges Ethanol in einem 20-l-Behälter. Das Volumenverhältnis wird so gewählt, dass eine endgültige Ethanolkonzentration von 70 % gewährleistet ist. Wenn das Organ mit 4 %iger Formalinlösung statt mit Ethanol präpariert wurde, um eine Austrocknung der Probe zu vermeiden, ersetzen Sie das 96 %ige Ethanol durch 4 %iges Formalin.

Ethanol ist brennbar. Halten Sie es von Wärmequellen fern und halten Sie immer einen Feuerlöscher bereit. Der Umgang mit Ethanol oder Formalin sollte immer unter einem Abzug erfolgen. Einatmen und Kontakt mit der Haut oder den Augen vermeiden. Verwenden Sie Sicherheitsausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, geschlossene Schuhe und Schutzbrille). Warten Sie, bis die Dichte der Blöcke der von Ethanol nahe kommt (~24 h).

Überprüfen Sie das Gleichgewicht der Lösung, indem Sie die Lösung rühren, um die Gelwürfel in Suspension zu bringen, und sicherstellen, dass sie langsam (über mehrere Dutzend Sekunden) auf den Boden des Behälters sinken.

Stellen Sie den Behälter mit den Agarwürfeln und dem Ethanol in den Exsikkator. Um den Exsikkator zu schließen, setzen Sie den Deckel auf und schließen Sie ihn langsam mit leichter Kraft. Drehen Sie den Deckel vorsichtig in beide Richtungen, um einen luftdichten Verschluss zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass der Exsikkator an die Vakuumpumpe angeschlossen ist.

Entgasen Sie die Lösung mit der Vakuumpumpe für zwei Zyklen von ca. 1 Stunde, um Risse in den Agarwürfeln zu vermeiden. Die Würfel sollten während des Vorgangs unter Wasser gehalten werden, um ein Austrocknen zu vermeiden. Vermeiden Sie es, die Würfel länger als 10 Minuten der Luft auszusetzen. Bewahren Sie ein Drittel der entgasten Würfel mit 70 %igem Ethanol in einem luftdichten Behälter auf.

Die restlichen Würfel mit einer elektrischen Reibe zerkleinern.

Bei der Verwendung elektrischer Geräte mit 70 %igem Ethanol besteht Brandgefahr. Das betreffende elektrische Gerät sollte über einen Motor mit Funkenschutz verfügen und die entsprechenden Brandschutzvorschriften müssen eingehalten werden.

Zur späteren Verwendung in einem luftdichten Behälter mit ausreichend 70 %iger Ethanollösung aufbewahren, um sicherzustellen, dass kein Agar aus der Lösung gelangt.

Entgasen Sie die Lösung kurz vor der Verwendung erneut.

Zeitaufwand ~3 Std

Füllen Sie den Boden des auslaufsicheren zylindrischen Behälters mit Agarosewürfeln von einigen Zentimetern Länge/Breite. Der Container ist in Extended Data Abb. 4 dargestellt.

Füllen Sie den Behälter zur Hälfte mit zerkleinertem Gel.

Verwenden Sie beim Manipulieren der Agarlösung eine Schöpfkelle mit vorsichtigen, langsamen Bewegungen, um eine Erhöhung des gelösten Gases in der Lösung oder den Einschluss von Blasen zu vermeiden.

Tauchen Sie das Organ vorsichtig in das Gel ein und platzieren Sie es in der gewünschten Position für die Bildgebung. Bedecken Sie die Orgel mit zerkleinertem Agar.

Entgasen Sie den gesamten Behälter, um eingeschlossene Blasen zu entfernen.

Dieser Entgasungsschritt zielt lediglich darauf ab, eingeschlossene Blasen zu entfernen. Da alle Komponenten zuvor entgast wurden, sollte dies die Menge an gelöstem Gas begrenzen. Diese Vakuumentgasung sollte nur mit kurzen Pumpzeiten (2–3 Minuten) über mehrere Zyklen hinweg durchgeführt werden, um die Entfernung der sichtbaren Blasen zu unterstützen.

Durch leichtes Klopfen auf den Exsikkator können die Blasen nach oben wandern

Fügen Sie mehr Agar-Ethanol-Lösung hinzu.

Drücken Sie mit einem Sieb von oben auf das Agar-Gel, um es rund um das Organ zu verdichten. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol mit einer Spritze von der Oberseite des Siebs und geben Sie dann ein Volumen Agar und Ethanol hinzu, das einem Viertel des Behälters entspricht.

Seien Sie vorsichtig, denn sobald der Agar kompakt ist, können die Blasen nicht mehr leicht nach oben steigen und daher kann an diesem Teil des Behälters keine Entgasung mehr durchgeführt werden. Alle Bewegungen müssen langsam und vorsichtig ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass beim Verdichten des Agars keine Blasen eingeschlossen werden.

Üben Sie manuell vertikalen Druck um die Probe aus, um das Agar um die Probe herum zu verdichten und die Probe in Position zu halten, bis sie sich im Gefäß nicht mehr bewegen kann.

Zwischen der Probe und der Behälterwand müssen mindestens 5 mm zerkleinertes Agargel verbleiben, um Randeffekte während der Röntgenbildgebung zu vermeiden.

Entgasen Sie den gesamten Behälter mit einer Vakuumpumpe, um das in den letzten drei Schritten hinzugefügte Gas zu entfernen und das Einschließen von Blasen im Agar-Gel zu vermeiden. Verwenden Sie Zyklen, um das Entweichen von Blasen zu erleichtern. Wenn nach einigen Zyklen bei der Inspektion keine Blasen sichtbar sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.

Wiederholen Sie die letzten vier Schritte, bis der Agar unter, um und über der Probe kompakt genug ist, um jegliche Bewegung der Probe zu vermeiden. Ein Beispiel für unzureichend verdichteten Agar wird im Online-Ergänzungsvideo 1 gezeigt.

Fehlerbehebung

Füllen Sie den auslaufsicheren Behälter bis zum Rand mit der Agar-Ethanol-Lösung und füllen Sie ihn abschließend mit einigen Agarwürfeln mit Lösung auf, um eine gute Probenblockierung zu gewährleisten.

Bohren Sie ein kleines Loch von einigen Millimetern Durchmesser in die Mitte des Deckels.

Schrauben Sie den Deckel auf den Behälter.

Wenn der Behälter nicht direkt dicht ist, verwenden Sie Dichtungsmaterial wie Parafilm-Latex oder Silikonkautschuk am Behältergewinde, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.

Überprüfen Sie nach dem Verschließen, ob die gesamte Luft aus dem Behälter entfernt wurde, indem Sie leichten Druck auf den Deckel ausüben und sicherstellen, dass Ethanol aus dem Loch austritt.

Agar kann das Loch verstopfen und den Austritt von Ethanol verhindern. Benutzen Sie in diesem Fall eine Nadel, um das Loch freizumachen

Kleben Sie ein Stück Klebeband auf das Loch im Deckel, um einen Gasaustausch zwischen der Innen- und Außenseite des Behälters zu verhindern und als Sicherheitsabsaugung zu dienen, falls beim Scannen Blasen entstehen.

Bringen Sie Klebeband rund um den Deckel an, um ihn zu schützen und ein versehentliches Öffnen zu verhindern.

Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Behälter verbleiben. Sobald der Agar kompakt ist, können die Blasen nicht mehr leicht nach oben wandern.

Das montierte Organ kann vor der Bildgebung Monate bis Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden und kann viele Male ohne Eingriff abgebildet werden, solange keine Blasenbildung aufgrund einer zu hohen Röntgendosis auftritt.

Fehlerbehebung

Timing variiert je nach Bildaufbau

Die Strahllinienparameter aller in diesem Artikel vorgestellten Organscans sind in der erweiterten Datenabbildung 6 detailliert aufgeführt. Weitere Beispiele für Setup-Parameter finden Sie bei Walsh et al.36. Die Schritte 37–43 sollten von einem umfassend ausgebildeten Synchrotron-Beamline-Wissenschaftler durchgeführt werden.

Bei gekühlten, montierten Organen nehmen Sie das Organ mindestens 12 Stunden vor dem Experiment aus dem Kühlschrank und lassen Sie es bei Raumtemperatur stehen, um Formänderungen während der Bildgebung aufgrund von Temperaturänderungen zu vermeiden.

Platzieren Sie die Orgel in ihrem verschlossenen Behälter auf dem Behälterhalter. Der von uns verwendete maßgeschneiderte Behälterhalter ist in den erweiterten Daten Abb. 5 beschrieben.

Platzieren Sie einen zweiten gleichwertigen Behälter (Referenzbehälter genannt) über dem Probenbehälter, der nur mit dem entsprechenden Eindeckungsmedium, z. B. Ethanol-Agar-Gel, gefüllt ist.

Richten Sie den Detektor mit einer Pixelgröße ein, die die Abbildung des gesamten Organs ermöglicht. Typischerweise kann bei einem Gehirn von 14 cm mit einer Kamera mit 5.056 Pixeln horizontal eine maximale Pixelgröße von 27,7 µm bei normaler Aufnahme erreicht werden.

Richten Sie den Detektor auf den Röntgenstrahl aus.

Passen Sie die Beamline-Schlitze an, indem Sie ihre Blende entsprechend dem Sichtfeld einstellen.

Gut angepasste Schlitze reduzieren die auf die Probe aufgebrachte Dosis.

Richten Sie die Probe am Detektor aus und ermitteln Sie das Rotationszentrum.

Passen Sie Energie und Fluss an, um eine ausreichende Durchdringung der Probe sicherzustellen. Die optimale durchschnittliche Energie hängt von der Größe des Gefäßes mit dem Organ ab. Typischerweise 80 keV für 10 cm, bis zu 110 keV für 15 cm, insbesondere wenn auf den Röntgenaufnahmen dichte Teile wie Knorpel oder Verkalkungen sichtbar sind. Der Fluss kann angepasst werden, um die Scangeschwindigkeit an die Anforderungen des Experiments anzupassen und gleichzeitig im richtigen Energiebereich zu bleiben und eine ausreichend niedrige Dosisrate beizubehalten, um Blasen zu vermeiden.

Es muss auf die auf die Probe aufgebrachte Dosis geachtet werden, um eine Blasenbildung während des Scans zu vermeiden. Dieser Schritt sollte von einem ausgebildeten Beamline-Wissenschaftler durchgeführt werden. Darüber hinaus hängt dieser Schritt stark von der Art und Größe der Probe sowie den Eigenschaften der Strahllinie und der Qualität der Entgasung der Probe ab.

Stellen Sie die Belichtungszeit und Akkumulation der Kamera ein. Typischerweise ermöglicht ein maximaler Pixelwert von 42.000 pro einzelnem Subframe für ein in 16 Bit codiertes Kamerasignal einen starken Sicherheitsspielraum, um eine Sättigung zu vermeiden und gleichzeitig die volle Dynamik der Kamera zu nutzen.

Eine Verlängerung der Belichtungszeit erhöht die Scanzeit und damit die auf die Probe aufgebrachte Dosis.

Stellen Sie sicher, dass die Kameradynamik optimiert ist und dass während des Scans keine Sättigung des Detektors auftritt.

Führen Sie einen Scan des Referenzcontainers durch.

Scannen Sie die komplette Orgel.

Der Strahllinienaufbau für den Referenzscan und den Probenscan muss identisch sein.

Fehlerbehebung

Erstellen Sie ein flaches Feld, indem Sie einen Durchschnitt aller Projektionen des in Schritt 44 durchgeführten Referenzscans erstellen.

Führen Sie eine Einzelschichtrekonstruktion durch, indem Sie das in Schritt 46 berechnete flache Feld anwenden und einen gefilterten Rückprojektionsalgorithmus66 in Verbindung mit einer Einzeldistanz-Phasenabfrage verwenden, um die Qualität der Scans sicherzustellen (die Rekonstruktion kann mithilfe einer tomografischen Rekonstruktion aus Open-Source-Quelle durchgeführt werden). Code wie PyHST2 (Ref. 67) oder TomoPy68).

(Optional) Wählen Sie interessante Merkmale auf den rekonstruierten Bildern aus.

(Optional) Berechnen Sie die Motorpositionen und richten Sie die Probe aus, um den entsprechenden Interessenbereich abzubilden.

(Optional) Wiederholen Sie die Schritte 37–47, um ausgewählte Regionen im Organ abzubilden.

Erstellen Sie alle 100 Projektionen eine partielle Winkelintegration aus dem Referenzscan, um eine Flatfield-Korrektur von Probenscan-Röntgenaufnahmen zu ermöglichen.

Wenden Sie die Flat-Field-Korrektur auf alle 100 Projektionen des Beispielscans an, wobei das entsprechende Flat-Field in Schritt 50 berechnet wird.

Rekonstruieren Sie das 3D-Volumen mithilfe eines gefilterten Rückprojektionsalgorithmus, gekoppelt mit einer Einzeldistanz-Phasenabfrage66 und einer 2D-Unschärfemaske (die Rekonstruktion kann mithilfe eines Open-Source-Tomographie-Rekonstruktionscodes wie PyHST2 (Ref. 67) oder TomoPy68 durchgeführt werden).

(Optional) Korrigieren Sie Ringartefakte auf rekonstruierten Slices mit dem aktualisierten Lyckegaard et al.69-Algorithmus (Code verfügbar auf GitHub, angegeben im Abschnitt Codeverfügbarkeit).

Timing variabel je nach Bildgebungstechnik

Bilden Sie die montierte Probe mit µCT19, klinischem CT70,71 oder MRT63 ab. Die Probe kann mit beliebig vielen dieser Bildgebungstechniken abgebildet werden.

(Optional) Führen Sie eine histologische Analyse der biologischen Probe durch. Wir verwendeten histologische Standardtechniken, die in Ross und Pawlina72 gut dokumentiert sind.

Hinweise zur Fehlerbehebung finden Sie in Tabelle 1.

Schritt 1, Organbeschaffung: ~3 Tage

Schritt 2, Fixierung des Organs: 4 d

Schritte 3–4A oder 3–4B, Vorbereitung der Orgel vor der Montage: 16–27 d

Schritte 5–16, Vorbereitung des Organmontagegels: 12 h–2 d

Schritte 17–32, Orgelmontage und Entgasung: ~3 h

Schritte 33–53, sCT-Bildgebung: Der Zeitpunkt hängt von der Bildgebungstechnik und dem Setup ab

Schritte 54–55, Bildgebung und Histologie: Der Zeitpunkt hängt von der Bildgebungstechnik und dem Aufbau ab

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Vorbereitung und Stabilisierung großer Organe oder biologischer Proben für die Bildgebung mit hoher Auflösung mithilfe von sCT, µCT, klinischer CT oder MR-Bildgebung. Typische Bilder von menschlichen Organen sind in den Abbildungen dargestellt. 2 und 5. Dieses Probenvorbereitungsverfahren liefert kontrastreiche Bilder (abhängig von der Bildgebungsmodalität), verhindert Probenbewegungen während des Scannens, ist mit mehreren Bildgebungsmodalitäten kompatibel und bewahrt die morphologischen Eigenschaften des Gewebes im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsmethoden wie Paraffin Einbettung. Die Probe kann ohne Bewegung oder Verschlechterung mindestens 1 Jahr lang gelagert werden. Diese Methode ermöglicht die 3D-Untersuchung großer biologischer Strukturen wie menschlicher Organe, ohne diese zu beschädigen. Diese hochauflösenden Bilder können qualitative und quantitative Informationen über die gesunden oder pathologischen Eigenschaften eines Organs liefern, beispielsweise die Wirkung von COVID-19 auf die menschliche Lunge36.

Bilddaten, die zur Erstellung der in diesem Protokollpapier enthaltenen Abbildungen verwendet wurden, sind im ESRF-Datenrepository (https://human-organ-atlas.esrf.eu) oder bei den entsprechenden Autoren öffentlich verfügbar.

Die sCT-Daten wurden mithilfe eines benutzerdefinierten Codes rekonstruiert, der in MATLAB 2017 geschrieben wurde und auf GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon) und dem Softwarepaket PyHST2 (https://software.pan-data.eu/software/74) verfügbar ist /pyhst2). Für das Volumenrendering wurde VGSTUDIO MAX 3.5 (Volume Graphics) verwendet.

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Referenzen herunterladen

Wir danken S. Bayat (INSERM) für die Hilfe während der Testphase, P. Masson (LADAF) für die Sektion von Spenderkörpern, H. Reichert (ESRF) und R. Tori für die allgemeine Unterstützung des Projekts und E. Boller, C . Muzelle, R. Homs, C. Jarnias, F. Cianciosi, P. Vieux, P. Cook, L. Capasso und A. Mirone für ihre Hilfe bei Setup-Entwicklungen und -Verbesserungen. Wir danken außerdem R. Engelhardt, A. Müller Brechlin, C. Petzold, N. Kroenke und M. Kuhel für ihre Hilfe bei Histologie und Autopsien. Dieses Projekt wurde teilweise durch die Zuschussnummer 2020-225394 der Chan Zuckerberg Initiative DAF, einem beratenden Fonds der Silicon Valley Community Foundation, und die Zuschussnummer CZIF2021-006424 der Chan Zuckerberg Initiative Foundation sowie die ESRF-Finanzierungsvorschläge md1252 und md1290 ermöglicht. der Royal Academy of Engineering (CiET1819/10). PDL und CLW danken dem MRC für die Finanzierung (MR/R025673/1). MA erkennt Zuschüsse der National Institutes of Health (HL94567 und HL134229) an. Diese Arbeit wurde vom Deutschen Register für COVID-19-Autopsien (DeRegCOVID, www.DeRegCOVID.ukaachen.de; gefördert durch das Bundesministerium für Gesundheit: ZMVI1-2520COR201) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Netzwerks unterstützt Universitätsmedizin (DEFEAT PANDEMIcs, 01KX2021).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: J. Brunet, CL Walsh.

Fakultät für Maschinenbau, University College London, London, Großbritannien

J. Brunet, CL Walsh, S. Marussi und Peter D. Lee

Europäische Synchrotronstrahlungsanlage, Grenoble, Frankreich

J. Brunet & Paul Tafforeau

Abteilung für Diagnostische und Interventionelle Radiologie, Universitätsklinikum Heidelberg, Heidelberg, Deutschland

W. L. Wagner

Translational Lung Research Center Heidelberg (TLRC), Deutsches Lungenforschungszentrum (DZL), Heidelberg, Deutschland

W. L. Wagner

Labor für Anatomie der französischen Alpen (LADAF), Universität Grenoble Alpes, Grenoble, Frankreich

A. Bellier

Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland

C. Werlein & DD Jonigk

Biomedizinische Forschung im Endstadium und obstruktiver Lungenerkrankung Hannover (BREATH), Deutsches Lungenforschungszentrum (DZL), Hannover, Deutschland

DD Jonigk

Antwerpener Zentrum für chirurgische Ausbildung, Anatomie und Forschung (ASTARC), Universität Antwerpen, Antwerpen, Belgien

SE Vergangenheit

Institut für Pathologie und Molekulare Pathologie, Helios Universitätsklinikum Wuppertal, Universität Witten/Herdecke, Wuppertal, Deutschland

M. Ackermann

Institut für Funktionelle und Klinische Anatomie, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Mainz, Deutschland

M. Ackermann

Forschungskomplex in Harwell, Didcot, Großbritannien

Peter D. Lee

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PT, PDL, DDJ, MA, CLW und WLW haben das Projekt konzipiert und Experimente entworfen. MA, CW, PT, AB, SEV, CLW und JB führten Autopsien und Probenvorbereitungen durch und trugen dazu bei. PT entwarf und baute Instrumente und führte HiP-CT-Bildgebung durch. Von SM entworfene Probenhalter. PT hat tomographische Rekonstruktionsmethoden entworfen und implementiert. JB, PT, CLW und PDL haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren waren bei der Durchsicht und Überarbeitung des Manuskripts behilflich.

Korrespondenz mit J. Brunet, CL Walsh, Peter D. Lee oder Paul Tafforeau.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Protocols dankt Ali Erturk, Stuart Stock und Hiroki Ueda für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Wichtige Referenzen zur Verwendung dieses Protokolls

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Dieses Protokoll wurde in einer iterativen Weise entwickelt, um alle verschiedenen Herausforderungen im Zusammenhang mit der Bildgebung von Weichgewebe, der Dosisabscheidung und der lokalen Tomographie zu bewältigen.

Die Herz-, Nieren- und Gehirndaten sind im Human Organ Atlas (https://human-organ-atlas.esrf.eu) enthalten. Die Leberdaten sind nicht im Human Organ Atlas enthalten, da in den Bildern aufgrund der Blasenbildung während des Scannens viele Artefakte auftreten. Die Bilder sind jedoch auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Bildung dieser Blasen erfolgte, weil ein Absturz in der Strahlführungssoftware dazu führte, dass der Strahl mehrere Stunden lang an derselben Position blieb und dabei die Dosisschwelle des Organs überschritt. Andere Lebern wurden ohne Artefakte gescannt.

Der in diesem Protokollpapier beschriebene Prozess sollte für alle wichtigen Organe funktionieren, es wurden jedoch nur die hier aufgeführten Organe getestet. Die hier aufgeführten maximalen Entgasungszeiten gelten speziell für unsere Vakuumentgasungsanlage und können sich je nach Pumpe, zu pumpendem Volumen, Pumpabschnitt, zu evakuierender Gasmenge und den Wegen, die das Gas nehmen kann, ändern Lassen Sie die Probe. Daher sollten sie an die Vakuumkonfiguration jedes Benutzers angepasst werden, indem die Blasenintensität berücksichtigt wird, wie in Schritt 4A(ii) des Protokolls erläutert.

Der linke auslaufsichere Behälter ist ein Medline Scientific-Behälter (Kat.-Nr. 129-0592) mit 3 l. Der rechte auslaufsichere Behälter ist ein Lock & Lock-Behälter (Kat.-Nr. INL-403) mit 2,1 l. Beides befinden sich in einem speziell angefertigten Behälterhalter, der in den erweiterten Daten in Abb. 5 beschrieben wird.

Im Inneren des maßgefertigten Behälterhalters sind zwei Behälter dargestellt. Der untere Behälter enthält die Probe, während der obere Behälter, der als Referenzbehälter bezeichnet wird, für die Flat-Field-Korrektur verwendet wird.

Die optimalen Scaneinstellungen hängen stark von der Probe sowie vom Aufbau und der Ausrüstung der Strahllinie ab. Die hier vorgestellten Parameter sind beispielhaft. Viertelaufnahme bedeutet einen Scan in halber Aufnahme plus einen ringförmigen Scan, um das seitliche Sichtfeld zu vergrößern. Mo = Molybdän.

Beispiel einer Probe, die mit nicht ausreichend verdichtetem Agar ausgestattet ist und eine Rotation bei einer leichten Bewegung zulässt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Brunet, J., Walsh, CL, Wagner, WL et al. Vorbereitung großer biologischer Proben für die hochauflösende, hierarchische Synchrotron-Phasenkontrasttomographie mit multimodaler Bildkompatibilität. Nat Protoc 18, 1441–1461 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

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Eingegangen: 21. Juni 2022

Angenommen: 12. Dezember 2022

Veröffentlicht: 01. März 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

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